Роман Смирнов
Технология CRISPR
Как ученые прошли путь от системы защиты бактерий до редактирования генома

Технология редактирования генома CRISPR в 2015 году была названа «прорывом года», ведь у учёных появилась возможность лечить заболевания уже на эмбриональном уровне, даже у новой образовавшейся зиготы. Редакторы журналов Science и Lancet зафиксировали двукратный рост числа статей, посвящённых новой технологии. Редактор проекта Fleming Роман Смирнов изучил историю возникновения новой технологии, благодаря которой, возможно, человечество забудет о врожденных генетических заболеваниях. 

История редактирования генома человека начинается с исследования бактерий. Они, как и человек, подвержены заражению вирусами, только особенными, называемыми бактериофагами (ранее в нашей статье про бактериофаги мы рассказывали о механизмах заражения бактериальной клетки вирусами). Примерно в 50-х годах прошлого века учёные обнаружили, что одни виды бактерий заражаются фагами медленнее, чем другие, но со временем вирусы адаптировались, и вся колония теряла резистентность к вирусу. Это явление объясняется высокой скоростью мутаций вируса. После ряда мутаций иммунитет бактерии не опознаёт вирус, и фаг свободно распространяется по колонии.

Yoshizumi_Ishino

Исино Ёсидзуми

В 1987 году группа японских учёных во главе с Исино Ёсидзуми заметили в геноме кишечной палочки (E. coli, самой любимой бактерии генетиков) повторяющиеся элементы, разделённые неповторяющимися последовательностями, названные впоследствии спейсерами (по аналогии с англ. space пробел). Впрочем, тогда учёные не придали своему наблюдению большого значения.

Испанский исследователь Франсиско Мохика в 1993 году обнаружил повторяющиеся последовательности, разделённые промежутками, в геноме археи Haloferax mediterranei. Мохика выявил, что строение генома археи близкое к геному кишечной палочки, однако E. coli и Haloferax mediterranei отличались друг от друга нуклеотидной последовательностью повторов. Учёный предположил принципиальное значение повторяющихся последовательностей в коде. Сперва он назвал новый класс повторов «регулярно разделённые короткие повторы» (англ. short regularly spaced repeats, SRSRs), однако впоследствии, по его предложению, название заменили на «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами» (англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR). Вскоре стали выделяться локусы CRISPR в различных микроорганизмах, а уже к 2000 году они были выявлены более чем у 20 микроорганизмов.

 

francis-mojica

Франсиско Мохика

Что это за участки ДНК, оставалось неизвестным. В 2002 году вблизи локусов CRISPR были обнаружены гены cas, кодирующие белки. Cas переносчики и ферменты-эндонуклеазы, разрезающие ДНК, однако тогда их функция ещё не была установлена. В 2005 году в некоторых штаммах кишечной палочки в локусе CRISPR были найдены фрагменты ДНК, соответствующей одному из бактериофагов E.coli P1. Оказалось, что CRISPR — это база данных бактерии о контактах с вирусами, подобная тому, как лимфоциты человека хранят информацию о контактах с инфекционными агентами, обеспечивая быстрый ответ иммунной системы на попадание в организм бактерий или вирусов, с которыми человек уже встречался. Механизм работы бактериального иммунитета сводился к тому, что если бактерии удавалось победить вирус, она как бы подбирала фрагменты его ДНК и встраивала в свой геном, формируя своего рода картотеку вирусов, с которыми она сталкивалась прежде. В ходе экспериментов, проводимых с 2006 по 2007 год, была доказана роль системы CRISPR/Cas9 в обеспечении адаптивного иммунитета бактерий. При необходимости система «доставала» из своей картотеки фрагмент и списывала с него РНК-копию. Копия присоединялась к белковому комплексу, содержащему в своём составе эндонуклеазу Cas9, и формировала рибонуклеопротеиновый комплекс. В свою очередь, комплекс связывался с чужеродным геном-мишенью, которой соответствовал исходный фрагмент, и белок Cas9 проводил разрезание чужой цепочки ДНК. Бактерии остаётся только «растворить» остатки генома вируса и использовать их по своему усмотрению. Своими «картотеками» бактерии могут обмениваться, например, во время половых процессов, которые у бактерий, в отличие от человека, связаны именно с обменом генетической информацией, а не слиянием ее от двух особей.

Как бы замечательно система не выглядела на первый взгляд, но фаги уже адаптировались и к ней. Они мутируют, чтобы миновать механизмы рестрикции. Они сбрасывают из своего генома участки, которые уже «засветились» перед бактерией. Они встраивают свой геном в спейсеры. Они мешают системе бить себя, встраивая белки между своим геномом и её «оружием», замедляя каскадные реакции образования новых рибонуклеопротеиновых комплексов. Однако, эволюция не стоит на месте: и бактерии, и фаги обретают новые методы борьбы друг с другом. Внезапно оказалось, что эта эволюционная война открывает возможность людям изменять свой геном.

Со временем обнаружилась способность CRISPR/Cas9 функционировать не только в прокариотических бактериальных, но и в человеческих эукариотических клетках. Особенности одновременного взаимодействия двух разнородных нуклеиновых кислот и белка позволила учёным менять белки в составе комплекса Cas и проводить не только разрезание ДНК, но и извлечение из неё фрагментов и даже их замену. Учёные в итоге остановились на Cas9 гноеродного стрептококка, так как его гены легче «оптимизировать» в соответствии с особенностями генома организма, которому требуется «починка», а набор РНК, по которым фермент определяет, где нужно разрезать ДНК, объединён в единую направляющую РНК.

rendering-nauka-dnk-spiral-3d

В идеале, генная терапия должна проводиться на раннем уровне развития человеческого организма. Наследуемый генный порок присутствует уже на этапе зиготы — когда будущий человек представлен несколькими почти идентичными клетками. Предположим, что у нас имеется человеческая зигота с генным дефектом фермента, ответственного за метаболизм галактозы в крови. Дефект гена и, как следствие, дефект фермента вызывает накопление спирта галактиола, избыток которого негативно действует на нервную систему, а также вызывает катаракту. Учёным уже известна последовательность нуклеотидов, присущая «правильному» гену. Остаётся только собрать правильный ген, присоединить к нему гены, кодирующие систему Cas, и внедрить их в клетку. По внедрённой матрице рибосомами синтезируются белки Cas, и, в свою очередь, они встраивают правильный ген на место дефектного. Из зиготы формируется человеческий организм без каких либо признаков нарушения метаболизма галактозы.

В 2012 году были проведены первые эксперименты по модификации генома с помощью системы CRISPR/Cas9. Процент ошибок в первых экспериментах был весьма высок, а сами эксперименты не были признаны «чистыми», но постепенно количество ошибок стало снижаться. Первые опыты ставились на растительных культурах, позже учёные взялись за животных. В 2013 году появились первые сообщения о редактировании генома стволовых клеток человека, больного муковисцидозом — заболеванием, нарушающим функцию внешних желёз и вызывающим разрастание соединительной ткани. Было сделано предположение, что исправленные клетки можно подсадить человеку и тем самым «привить» нормальный ген всем клеткам организма.

Казалось бы, неизлечимых болезней больше нет, но в апреле 2015 года эксперимент китайских учёных (в этой стране этические нормы для медицины гораздо шире, чем в современных западных странах) на человеческих эмбрионах показал: метод требует совершенствования. Не всё шло гладко: заменить гены удалось только в четырёх случаях из более чем пятидесяти, да и там CRISPR/Cas9 пока всё решала за них. Она не только изменила гены, которые планировалось изменить, но и внесла изменения в те участки генома, которые теоретически не должны были затрагиваться. Учёные сделали официальное заявление, что на данный момент система CRISPR/Cas9 небезопасна для использования в практике. Своим исследованием китайцы подняли на новый уровень вопросы этики касательно использования человеческих эмбрионов в экспериментальных целях; и хотя учёные из Поднебесной утверждали, что эмбрионы были нежизнеспособны, они не были услышаны. Мир загорелся идеей проектирования детей, как в фильме Эндрю Никкола «Гаттака». Работы над усовершенствованием метода были продолжены.

В декабре того же года учёные Массачусетского университета представили результаты своей работы с CRISPR/Cas9. Модифицировав код сas, учёные резко повысили точность работы системы. С 1 февраля 2016 года в Великобритании официально разрешены эксперименты с CRISPR/Cas9 на человеческих эмбрионах. Предполагается, что точность работы системы будет настолько высока, что Cas9 будет совершать не более одной ошибки на 300 трлн. нуклеотидов. Сегодня работу учёных с технологией редактирования генома можно представить как игру ребёнка на детской площадке, размеры которой сопоставимы с размером Земли, но лишь как игру и не более. Геном человека меняется сам по себе под воздействием внешней среды, и учёным постоянно необходимо «быть в тренде» всех изменений человеческой генетики.

Перспективы CRISPR/Cas9 огромны, но говорить о внедрении техник изменения генома в практику пока рано. Этому мешают и этические вопросы, и несовершенство системы, и меняющийся с точки зрения генетики человек. Быть может, человечество не станет злоупотреблять новым молекулярным инструментом и будет использовать его в целях лечения генетических заболеваний, а не пытаться вырастить сверхчеловека. В любом случае, это дело нескольких десятилетий.


Если вы нашли опечатку, выделите её и нажмите Ctrl+Enter


Понравилась статья? Подпишитесь!

Ящик Пандоры

Откуда появился, как эволюционировал и как устроен вирус иммунодефицита человека

Лучше один раз попробовать

Три истории об ученых, которые поставили эксперименты на себе, и что из этого вышло